污泥-廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵培養(yǎng)Bt 生物殺蟲劑

   1 材料與方法
　　1.1 菌種
　　蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki 130-1, 四川師范大學胡佩博士惠贈, 本實驗室保藏。

　　1.2 供試材料
　　1.2.1 城市污泥
　　采自北京高碑店污水處理廠, 為未經消化的濃縮污泥, 理化性質見表1。采回置于4 ℃ 冰箱中保存, 待與廢糖蜜復配。
　　1.2.2 廢糖蜜
　　俗稱桔水,采自南寧,褐色,粘稠狀, 4℃ 冰箱保存。經分析, 含固率約為70%, pH = 4190, 還原糖含量562.3 g/kg , 粗蛋白15.7 g/kg。

　　1.3 培養(yǎng)基
　　(1)固體培養(yǎng)基, 即BP 培養(yǎng)基( g/L) : 牛肉膏510, 蛋白胨10.0, NaCl 5.0, 瓊脂粉15.0, pH 7.2;
　　(2)液體培養(yǎng)基: 固體培養(yǎng)基成分中除去瓊脂粉, 用作種子培養(yǎng)基;
　　(3)發(fā)酵培養(yǎng)基: 污泥與廢糖蜜復配, 隨廢糖蜜添加比例的不同, 分為6 個處理, 編號A--F( A: 原污泥; B: 污泥+0.5% 廢糖蜜; C: 污泥+ 1.0% 廢糖蜜;D: 污泥+ 1.5% 廢糖蜜; E: 污泥+ 2.0% 廢糖蜜; F:污泥+ 2.5%廢糖蜜) , 混勻后用4mol/L的NaOH和HCl 調節(jié)pH, 使滅菌后pH 在7.0 左右。
　　1.4 接種物
　　250mL 錐形瓶內盛50mL Bp液體培養(yǎng)基, 從斜面培養(yǎng)基中移取一環(huán)Bt 接種,于( 30±1) ℃和200/min往復式搖床培10h。預試驗表明, 此時Bt處于對數生長期, 是接種的適宜時期。
　　1.5 搖瓶發(fā)酵試驗
　　500mL 錐形瓶內盛100mL 各組合發(fā)酵培養(yǎng)基,移取2% ( 體積比) 上述接種物。接種后于( 30±1)℃, 200 r/min的往復式搖床培養(yǎng)48h, 每隔3h 移取發(fā)酵液3mL, 測定pH、活菌數及活芽孢數。至48 h發(fā)酵完成時用25%磷酸調節(jié)pH 至5.0-5.5, 待測晶體蛋白含量及殺蟲毒效。
　　1.6 分析方法
　　活菌數( VC) 與活芽孢數( VS) : 采用無菌操作,將發(fā)酵液進行梯度稀釋, 取適宜稀釋度的菌液涂布平板, 于30℃恒溫培養(yǎng)16~-18h 后計活菌數; 對于活芽孢數, 需將適宜稀釋度的菌液于80℃水浴處理15min, 然后進行涂布培養(yǎng)計數, 每平板菌數在30-300 CFU( Colony forming unit, 菌落形成單位) 內有效。晶體蛋白含量測定: 按照《中華人民共和國國家標準》GB/T 19567.3-2004 中的SDS-PAGE 洗脫比色法測定晶體蛋白含量, 以130000 Da作為測定條帶。
    殺蟲毒效生物測定: 根據國家標準《蘇云金芽孢桿菌懸浮劑》GB/T 19567.2-2004 對產品毒效進行生物測定。以小菜蛾( Plutella xylostrella ) 為標準供試蟲種, 以湖北省農業(yè)科學院生物農藥工程中心提供的CS-1991 (H_3a3b) 為標準對照( 標準品毒力效價:55 000 IU/mg) , 按照標準化程序進行毒力效價測定。數據采用SPSS 統(tǒng)計軟件進行ANOVA 方差分析, 兩兩比較采用t 檢驗。

　　2 結果與討論
　　2.1 生長代謝狀況
　　Bt 是一類化能有機營養(yǎng)型細菌, 只能利用有機含碳化合物作為碳源和能源。自然界的含碳化合物種類繁多, 并非都能被Bt 利用, 常用作碳源的主要是糖類。城市污泥中總碳含量高達30%-40% ,但易為Bt 同化利用的還原糖、淀粉等在碳源中所占比例很低, 不超過污泥干重的3%。因此以污泥作為培養(yǎng)基質時, Bt 往往因碳素營養(yǎng)不足而過早進入穩(wěn)定期 , 導致發(fā)酵液中活菌數較低, 限制了后續(xù)的芽孢形成與晶體蛋白合成, 從而降低了發(fā)酵液的生物毒效。針對污泥可利用碳源不足, 本研究考察了污泥-廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵, 通過逐步提高廢糖蜜添加比例, 形成了一系列復配培養(yǎng)基。搖瓶發(fā)酵48h, 過程中VC、VS 與pH 的動態(tài)變化如圖1 所示。
　　觀察圖1 , 當采用含固率為3% 的污泥作為唯一培養(yǎng)基時, 菌體生長的指數期較短, 活菌數增幅較小, 發(fā)酵6hVC 出現第一次峰值, 僅有6.33×10⁷CFU/mL , 遠遠低于同期污泥-廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵的結果, 而后進入芽孢形成期, 受指數期菌體大量增殖的影響, 此時培養(yǎng)基中溶解氧處于較低水平, 菌體的穩(wěn)定性及菌落形成能力較差 ,VC 值下降明顯,盡管發(fā)酵后期迅速上升, 活菌數還是受到一定影響,VC 最大值出現在36h, 為2.57 ×10⁸CFU/mL。而從VC 曲線比較可以看出, 在0%-2.5% 的廢糖蜜添加比例范圍內, 污泥-廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵明顯優(yōu)于污泥本身, 且隨著廢糖蜜比例的提高, 指數期持續(xù)時間加長, 活菌數也明顯增加。例如, 添加2.5% 廢糖蜜的培養(yǎng)基發(fā)酵9h 時, VC 值可達5.46 ×10⁸CFU/mL , 是同期污泥單獨發(fā)酵的9 倍。另外, 廢糖蜜的添加也改善了芽孢形成初期VC 值回落的現象, 有利于緩解曲線的/ 雙對數現象。添加1.5% 廢糖蜜的培養(yǎng)基VC 值僅有輕度回落, 且持續(xù)時間較短, 說明適量增加污泥中的還原糖含量有利于提高芽孢形成期菌體的穩(wěn)定性。至發(fā)酵終點( 48h) , 最高VC 值出現在F 處理( 污泥+ 2.5% 廢糖蜜) , 約為2.95 ×10⁸CFU/mL, 比不加糖蜜的單一污泥發(fā)酵( 1.80×10⁸CFU/mL) 高出63.9%。
    進一步觀察圖1( b) 可以發(fā)現, 當廢糖蜜添加比例≤2.0% 時, 芽孢的形成在12-18 h 最旺盛, 發(fā)酵24 h 時抗熱性芽孢已基本成熟, 此時用晶體與芽孢區(qū)別染色法可明顯觀察到菌體的一端為染成藍色的晶體, 另一端是無色透明的芽孢。當糖蜜添加比例> 2.0%時, 由于碳素含量過高, 芽孢的形成明顯延滯, 48 h 才能觀察到成熟的芽孢和晶體, 并且數量只有9.0×10⁷CFU/mL 。在整個發(fā)酵過程中,VS 最大值出現在添加1.5% 廢糖蜜的培養(yǎng)基發(fā)酵24 h 時, 約為3.6 ×10⁸CFU/mL。

　　圖1( c) 顯示了廢糖蜜添加比例對Bt 發(fā)酵液pH變化的影響。隨廢糖蜜添加比例的提高, 糖代謝引起的pH 下降程度明顯加強, 持續(xù)時間也逐漸增長。特別是廢糖蜜添加比例為215% 的處理, pH 可持續(xù)降至最低值6.10, 培養(yǎng)基長期處于低pH 水平, 可能對菌體代謝產生負面影響, 致使芽孢形成延遲, 發(fā)酵周期延長。綜上所述, 作為污泥發(fā)酵培養(yǎng)Bt 的補充碳源,廢糖蜜的添加比例為1.5% ( 質量比) 時, 對Bt 生長代謝最為有利, 發(fā)酵過程中活菌數與活芽孢數最大值可分別達到4.17×10⁸和3.603.6 ×10⁸CFU/mL。
　　2.2 晶體蛋白產量
　　Bt 的主要殺蟲活性物質是伴孢晶體( 晶體蛋白, 簡稱Cry) 。在昆蟲中腸堿性條件下, Cry 被降解為毒性蛋白肽, 破壞中腸上皮細胞, 同時芽孢侵入增殖, 導致昆蟲痙攣或敗血癥而死 。Cry 的合成受培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件的影響顯著。對上述各復配培養(yǎng)基48 h 的發(fā)酵終產物進行SDS-PAGE 電泳, 并與高分子量蛋白Marker 進行對照( 如圖2 所示) , 經計算該菌株的晶體蛋白分子量在約為130000 Da, 是對鱗翅目昆蟲有毒效的特征蛋白。圖2 同時也直觀地顯示了不同添加比例的廢糖蜜對發(fā)酵液中晶體蛋白含量的影響, 當廢糖蜜添加比例< 210%時, 隨著添加比例的提高, 蛋白帶變寬變深,說明適量添加碳源有利于晶體蛋白合成與積累; 繼續(xù)添加廢糖蜜( > 2.0% ) 時, 晶體蛋白帶明顯變淺, 說明過多的碳源抑制了晶體蛋白合成。

　　進一步割膠比色, 并將吸光值代入同步操作的標準晶體蛋白回歸方程( y = 124.224x + 4.12924,R = 0.997, 其中x-ABS, y-Cry/mg/mL) , 得到不同復配培養(yǎng)基發(fā)酵終點的晶體蛋白含量, 如圖3 所示。A-F 6 組間的方差分析結果顯示, 除C 與E 兩組間蛋白含量無顯著差異外, 其余各組兩兩間均存在顯著性差異( P < 0.01) 。這說明適當添加廢糖蜜可顯著提高晶體蛋白產量, 添加1.5% 廢糖蜜時發(fā)酵液Cry 濃度最高, 達1196mg/mL。而繼續(xù)提高廢糖蜜添加比例至215% 時, Cry 產量卻迅速降至0.28mg/mL, 推斷這是由于過量廢糖蜜導致發(fā)酵周期延長, 芽孢不易形成, 同時晶體蛋白的合成受到延滯或抑制。

　　2.3 生物毒力效價
　　實驗以2齡末小菜蛾幼蟲作為試蟲, 接蟲感染48h 后發(fā)現, Bt 發(fā)酵液對小菜蛾有明顯殺蟲活性, 感染Bt 而死亡的昆蟲可觀察到全身變黑、腐爛并萎縮, 死亡率與晶體蛋白濃度梯度顯著相關, 具體數據如表2 所示。從表2 中可以看出, 除添加2.5%廢糖蜜的培養(yǎng)基外, 其他復配培養(yǎng)基LC₅₀都在1μL/mL以下, 顯著低于單一污泥發(fā)酵的培養(yǎng)基, 且廢糖蜜最適宜的添加比例在1.0%-2.0%之間。通過與標準品進行代換, 得出48 h 各發(fā)酵液的毒效(Tx ) , 從中可以看出隨廢糖蜜添加比例的提高, 毒效呈階梯上升, 添加115%廢糖蜜的培養(yǎng)基毒效最高( 為788IU/μL) 。而繼續(xù)提高廢糖蜜添加比例毒效反而顯著下降, 與晶體蛋白含量反映的趨勢相同。

    2.4 晶體蛋白含量與生物毒效的相關性分析
　　生物毒效是表征發(fā)酵性能的最有效指針。但它的測定費時費力, 因此在Bt 生產中往往期望能用簡單快速的方法( 例如芽孢數量或晶體蛋白含量) 來監(jiān)控發(fā)酵過程與產品質量。事實上, 發(fā)酵液最終毒效是發(fā)酵過程中營養(yǎng)體增殖、芽孢形成及晶體蛋白合成的綜合反映。正常生長的營養(yǎng)體是形成芽孢的基礎, 而伴孢晶體的合成以芽孢形成為前提。圖4 分別反映了各培養(yǎng)基發(fā)酵48 h 時VS 與Tx、Cry 產量與Tx 的相關性。SPSS 分析結果顯示, VS 與Tx 的相關性不顯著( R = 01795, n = 6, P > 0105) ; 而Cry 產量與Tx 極顯著相關( R = 01971, n= 6, P < 0.01) , 說明芽孢數量不能作為表征發(fā)酵液生物毒效的定量依據, 而晶體蛋白含量可用作表征發(fā)酵性能的簡單、可靠的方法, 大大縮短生物毒效測定周期與費用, 在Bt 生產中有一定實用價值。

　　3 結 論
　　(1) 廢糖蜜是污泥發(fā)酵培養(yǎng)Bt 的良好補充碳源。適量添加廢糖蜜( ≤2.0% ) 可以改善發(fā)酵過程中Bt 生長代謝狀況( 包括菌數增長、芽孢形成與晶體蛋白合成) 與發(fā)酵液的生物毒效; 但當廢糖蜜添加比例> 210%時明顯抑制發(fā)酵過程。
　　( 2) 以含固率3%的污泥為對照, 通過改變廢糖蜜添加比例得出污泥-廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵培養(yǎng)Bt 的最佳復配比例為: 污泥+ 1.5%廢糖蜜, 此時Bt 生長最旺盛, 活菌落數與活芽孢數最大值可分別達到4.17×10⁸CFU/mL和3.60×10⁸CFU/mL , 晶體蛋白產量與殺蟲毒效最高, 是污泥單獨發(fā)酵的3-4 倍。
　　( 3) 晶體蛋白產量與發(fā)酵液生物毒效有極顯著相關性, 可用作表征Bt 發(fā)酵性能的簡單、實用、可靠的指標。
　　(4) 本研究通過污泥-廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵生產Bt生物殺蟲劑, 為兩種有機廢棄物的資源高值化利用提供了一條新的有用途徑。（本文搜集整理于網絡，如有侵權之處，請聯(lián)系我們刪除。）