利用廢糖蜜生產(chǎn)SCP菌種性能的測(cè)定

    分別以白地霉、熱帶假絲酵母、皮狀絲孢酵母和產(chǎn)朊假絲酵母為研究對(duì)象，以糖蜜廢液為培養(yǎng)基，通過(guò)恒溫培養(yǎng)，測(cè)定活細(xì)菌數(shù)、細(xì)胞干重和菌體蛋白質(zhì)含量等指標(biāo)比較，從而選育生長(zhǎng)快、蛋白質(zhì)含量高的菌種生產(chǎn)SCP。結(jié)果表明，熱帶假絲酵母生長(zhǎng)較快、粗蛋白含量較高，為生產(chǎn)SCP 的最佳菌種。

　　【關(guān)鍵詞】菌種性能；恒溫培養(yǎng)；SCP

    廢糖蜜是糖廠的副產(chǎn)物，具有產(chǎn)量大含糖量高的特點(diǎn)，其中含有大量酵母可以利用的可發(fā)酵性糖。因此廢糖蜜是一種可以被利用生產(chǎn)SCP的資源，隨著糖蜜的產(chǎn)量日益增加和畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，進(jìn)行利用廢糖蜜開發(fā)蛋白飼料的研究是非常必要的。利用廢糖蜜生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，不僅能提高廢糖蜜的附加值，而且還可以充分利用廢棄物，在有效地保護(hù)環(huán)境的同時(shí)，可以帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)效益。但用于生產(chǎn)SCP的菌種很多，如白地霉、熱帶假絲酵母、釀酒酵母等。作為SCP生產(chǎn)菌，除了要具有無(wú)生理毒性的最基本特征外，菌體生長(zhǎng)速度、生物量、菌體蛋白量等特性是影響生產(chǎn)率的最主要因素。因此，發(fā)酵生產(chǎn)SCP選擇菌種時(shí)，一定要進(jìn)行菌種性能測(cè)定。

　　材料和方法
　　材料和設(shè)備:
　　試驗(yàn)菌株白地霉（Geotrichum candidum link）：GIM2.69、熱帶假絲酵母（Candidia tropicals）：AS2.637、皮狀絲孢酵母（Trichosporoncutaneum）：AS2.570、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilislooderet Kreger—van Rij）：As2.81 （由廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心提供）。
    試驗(yàn)設(shè)備振蕩培養(yǎng)箱（SPX－150B－2 型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、生化培養(yǎng)箱（LRH－250A 型，廣東省醫(yī)療器械廠）、手提式高壓滅菌器（YXQ.SG41－280A 型）、離心機(jī)（800 型，常州國(guó)華電器有限公司）、磁力攪拌器（HJ－3 型，常州國(guó)華電器有限公司）、精密pH 計(jì)（PHS－3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司）、手持糖量計(jì)（WYTO－80%型，成都泰華光學(xué)有限公司）、蛋白質(zhì)測(cè)定儀（KDN－04 型，上海纖檢儀器有限公司）、生物潔凈工作臺(tái)（BCM－1000 型，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。
　　實(shí)驗(yàn)原料
　　甘蔗廢糖蜜;
　　試驗(yàn)方法
　　工藝流程:廢糖蜜→加水稀釋→酸化澄清→加營(yíng)養(yǎng)鹽→投加菌種發(fā)酵離心→干燥→單細(xì)胞蛋白
　�。�1）廢糖蜜加水稀釋：將廢糖蜜和水按體積比1：1 稀釋，稀釋后B°x 錘度達(dá)到45%。
　　（2）酸化澄清：加1＋9 鹽酸，混合均勻，靜置12h，取上清液，調(diào)節(jié)稀糖蜜的pH 值至4.5。
　�。�3）加營(yíng)養(yǎng)鹽：冷卻后，加入一定量的磷酸鹽、銨鹽。
　�。�4）發(fā)酵：接種量為0.6g 濕菌體每800ml，接種后，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中100r/min 進(jìn)行酵母培養(yǎng)。發(fā)酵液離心分離，烘干后即得單細(xì)胞蛋白。
　　培養(yǎng)基的制備:
　　固體培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基，加瓊脂2%；搖床液體培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基。
　　菌種的活化方法:
　　冷藏的菌種接種在麥芽汁固體培養(yǎng)基試管鞋斜面上，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，溫度為30℃。
　　菌種的富集培養(yǎng):
　　無(wú)菌條件下分別將活化的熱帶假絲酵母、白地霉、皮狀絲孢酵母、產(chǎn)朊假絲酵母接種與50ml 麥芽汁液體培養(yǎng)基的250ml 三角瓶中。然后置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為105r/min，溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h。
　　測(cè)定方法
　　生長(zhǎng)速率的測(cè)定方法:
　　1.細(xì)胞濃度測(cè)定方法
　　采用平皿菌落計(jì)數(shù)法。每12h 取樣一次，無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行稀釋，涂布。菌種的稀釋度均為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 和10-10，四種菌種的平板接種量均為1ml。2.3.1 .2 菌體生物量（以細(xì)胞干重表示）測(cè)定方法[5]量取細(xì)胞培養(yǎng)液50ml，用離心機(jī)離心分離，轉(zhuǎn)速為4000r/min,離心15min。離心之后經(jīng)過(guò)預(yù)處理（見(jiàn)圖1），去除培養(yǎng)基成分，將濕菌體置于干燥箱中在105℃下烘干至恒重，然后稱重。

　　2.粗蛋白的測(cè)定
　　蛋白質(zhì)測(cè)定儀
　　結(jié)果與分析
　　1.菌種細(xì)胞濃度與時(shí)間的關(guān)系
微生物量（細(xì)胞的總重量）通常與細(xì)胞數(shù)目成正比（圖2）。微生物的生長(zhǎng)經(jīng)歷了適應(yīng)期、緩慢增長(zhǎng)期、對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期、穩(wěn)定增長(zhǎng)期、衰亡期五個(gè)階段。以產(chǎn)朊假絲酵母為例，0- 12h 為適應(yīng)期，12- 24h 為緩慢增長(zhǎng)期、　　24- 60h 為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，60- 96h 為穩(wěn)定期，96h 以后為衰亡期。從圖中可以看出72h 后四株菌株的細(xì)胞濃度基本都達(dá)到最大值。此時(shí)，產(chǎn)朊假絲酵母的細(xì)胞濃度對(duì)數(shù)為20.57，即細(xì)胞濃度達(dá)8.57×108。產(chǎn)朊假絲酵母的適應(yīng)期最短，增長(zhǎng)速度最快，其次是熱帶假絲酵母和皮狀絲孢酵母，細(xì)胞濃度最低的是白地霉。

　　2.菌體干重與時(shí)間的關(guān)系
　　不同菌株的生長(zhǎng)穩(wěn)定期有所差異（圖3）。生長(zhǎng)穩(wěn)定期后，菌體干重都趨于最大。生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白可在菌體的生長(zhǎng)穩(wěn)定期結(jié)束發(fā)酵。如產(chǎn)朊假絲酵母的生長(zhǎng)穩(wěn)定期在48- 84h，其在培養(yǎng)84h 后菌體干重可達(dá)到0.3293g/49ml，菌體生物量最大。其次是熱帶假絲酵母，可達(dá)到0.3156g/49ml。白地霉和皮狀絲孢酵母的細(xì)胞干重分別為0.2461g/49ml 和0.2811g/49ml。熱帶假絲酵母的最終菌體干重和產(chǎn)朊假絲酵母相當(dāng)，說(shuō)明其在到達(dá)穩(wěn)定期后從基質(zhì)中獲得碳源的能力和產(chǎn)朊假絲酵母相當(dāng)，從而合成了與其相當(dāng)?shù)木w。

　　3.粗蛋白含量
　　用凱式定氮儀分別測(cè)定四株菌株細(xì)胞的粗蛋白含量（表2）。由表2 可見(jiàn)，皮狀絲飽酵母的粗蛋白含量明顯高于其他三種菌種，其次是熱帶假絲酵母和白地霉，產(chǎn)朊假絲酵母的蛋白質(zhì)含量最低。

　　4 菌體蛋白產(chǎn)量
　　綜合分析各個(gè)菌種的微生物量及其粗蛋白含量可以得出菌體的蛋白質(zhì)產(chǎn)量（表3）。熱帶假絲酵母的蛋白質(zhì)產(chǎn)量最高達(dá)到了0.153g/49ml，其次是皮狀絲飽酵母和產(chǎn)朊假絲酵母，白地霉蛋白產(chǎn)量最低。熱帶假絲酵母是比較理想的產(chǎn)SCP 菌體，其生長(zhǎng)速度和蛋白質(zhì)含量都較高。

　　熱帶假絲酵母與進(jìn)口魚粉氨基酸種類與含量比較結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知熱帶假絲酵母所含氨基酸種類齊全，且與進(jìn)口魚粉所含所含氨基酸種類和含量接近，特別是他包含了人體所需的八種必備的氨基酸，即賴氨酸（Lys）、蘇氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Lle）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、色氨酸（Try）和苯丙氨酸（Pro）非常適合與生產(chǎn)人畜可食用單細(xì)胞蛋白。

　　結(jié)論
　　通過(guò)發(fā)酵對(duì)生產(chǎn)SCP 的四株菌株性能的測(cè)定可知，熱帶假絲酵母在糖蜜廢液培養(yǎng)基中能夠較快適應(yīng)，是生長(zhǎng)率快、粗蛋白含量較高、產(chǎn)蛋白量高的菌株，且其氨基酸種類和進(jìn)口魚粉相當(dāng)，是利用糖蜜廢液生產(chǎn)SCP 的最佳菌種。（本文搜集整理于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)之處，請(qǐng)聯(lián)系我們刪除。）